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暗場顯微成像技術（DFM）和表面增強的拉曼光譜（SERS）和新興的分析技術, 已廣泛應用于化學檢測和生物傳感的快速診斷分析。近期，卓立漢光集團拜訪合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院劉洪林教授課題組，課題組基于DFM和SERS這兩個關鍵技術在獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定方面開展了相關研究工作。
該研究成果以“Early warning of Diaporthe infection in kiwifruit soft rot by plasmonic dimer-enhanced Raman spectroscopy”為題發(fā)表在Iscience期刊中。
獼猴桃（Kiwifruit）富含充足的維生素C，具有抗氧化特性，受到廣泛關注。然而，其易受真菌病原體的侵害，在生長和儲存階段導致軟腐病，致使嚴重經濟損失。擬莖點霉菌屬是一種常見的軟腐病致病菌屬。迄今為止，對這類致病菌的研究較少，亟需開發(fā)一種方便、快速、敏感的早期預警或診斷方法。
近日，研究團隊篩選了一對致病菌屬水平的特異性引物，并基于此基礎開發(fā)了一種超靈敏的SERS檢測方法，用于早期獼猴桃中擬莖點霉菌屬的特異性檢測。采用RGBtoHSI算法輔助DFM成像實驗調節(jié)引物修飾密度，促進靶點誘導的金顆粒二聚化形成，在感染24h后即可實現陽性報告。與傳統PCR法相比，該新型SERS方法對擬莖點霉菌屬具有良好的特異性和超敏感性，為獼猴桃軟腐病病原菌感染的早期預警提供了良好的檢測技術手段。
圖1. 擬莖點霉菌屬的引物篩選
從NCBI GenBank數據庫中獲得靶點目的基因核苷酸序列，通過DNAMAN比對確定擬莖點霉菌屬的保守區(qū)和可變區(qū)，用于引物設計。研究團隊設計了一條檢測引物(P1)；一條兼并引物(P2)。特異性引物可以從四株擬莖點霉菌屬中擴增出一條清晰的條帶，而其他屬的12種真菌在相同條件下沒有擴增，證實了引物的特異性。
圖2. 擬莖點霉菌屬引物協助金顆粒二聚化助力等離子體SERS和DFM信號的增強
P1和P2兩個引物探針可以與目標物互補配對，錨定在金顆粒表面形成等離子體納米探針。利用P1和P2兩個引物探針縮短目標片段的長度，目標鏈在退火過程中與引物探針雜交形成Y型雙鏈，促使金顆粒二聚化，便于后續(xù)DFM成像和SERS檢測。
圖3. DFM表征金顆粒二聚化組裝過程
為了提高分類和定量分析的準確性，研究團隊首先利用DFM優(yōu)化了修飾在金顆粒表面引物探針的濃度，其原理主要是不同的等離子體納米探針聚集狀態(tài)在DFM下顯示出不同的顏色。由于局域表面等離子體共振耦合效應，綠點和黃點代表金顆粒單個納米探針和金顆粒二聚體，橙點和紅點則是更大的成簇聚集體。研究團隊發(fā)現在引物探針比例合適的條件下，待檢目標物誘導的聚集更傾向于金顆粒二聚體而不是大的成簇聚集體，即DFM觀察到的黃點較多，紅點較少。隨后采用RGBtoHSI算法對DFM成像納米探針的簇類型進行區(qū)分和統計。根據分類的結果，用小矩形重新繪制斑點，繪制圖像與原始DFM圖像一致，說明了算法的可行性。
圖5. 植物病原菌基因組DNA的雙盲檢測
接下來，研究團隊利用SERS探究金顆粒二聚體組裝過程。1326 cm−1波長處SERS信號的增強，表明隨著待測目標濃度的增加，金顆粒二聚體增加，該結果與上述DFM成像的納米探針聚集狀態(tài)相匹配。提取獼猴桃軟腐病十八種已知病原體的基因組DNA進行雙盲測試，檢測結果與預先標記一致，表明SERS檢測在實際應用中基因組DNA進行分析的特異性和可行性。
圖6. 真正感染獼猴桃軟腐病的預警
最后，研究人員探究了SERS方法檢測病原體感染獼猴桃的適用性和敏感性。收集不同時間點的感染組織，提取基因組DNA，進行SERS檢測。與PCR法相比較，感染24 h后，感染組產生的SERS信號明顯高于對照組。這些結果都表明SERS檢測法比PCR法更敏感，可以在沒有明顯癥狀的情況下診斷患病的獼猴桃，更適合用于獼猴桃軟腐病感染的早期預警。
獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定實驗手冊流程圖
此外，研究團隊還凝練了獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定實驗手冊。該實驗手冊中詳細介紹了如何篩選擬莖點霉菌屬的保守區(qū)域，并設計合適的納米探針。傳統的檢測方法，例如基于病原體特征的表觀分析，病理檢測和聚合酶鏈反應(PCR)方法，它們要么耗時長，要么靈敏度低，不適合實際的應用。通過DFM對不同金顆粒聚集狀態(tài)進行分類；利用SERS對樣品進行檢測具有方便、快速和靈敏度高的優(yōu)勢。首先，利用MEGA7篩選擬莖點霉菌屬的保守序列，設計引物互補序列構建納米探針；隨后， 利用DFM技術分別對金顆粒的聚集狀態(tài)進行分類和信號觀察。同時，利用Fiji-ImageJ 2軟件代碼轉換實現DFM圖像的批量處理。最后，利用便攜式拉曼光譜儀實現了對擬莖點霉菌屬不同種屬的快速檢測。
綜上所述，一方面，基于DFM技術研究團隊開發(fā)了一種無“系繩”連接的單分子偶極與單個金顆粒之間的PRET納米尺模型，在活細胞受體蛋白分子水平上測量了位點間分離距離和蛋白質互作。該新型納米尺具有抗自淬滅和光漂白的穩(wěn)定性，在觀察單分子事件方面具有獨特的優(yōu)勢，為納米尺度距離測量增添了新的替代工具，在未來食品與生物工程領域的生物標志物檢測和靶標鑒定方面具有重要的科學意義。另一方面，基于DFM和SRES技術，開發(fā)了一種等離子體二聚化SERS檢測方法，能夠在獼猴桃感染軟腐病的早期24小時內檢出致病菌。通過DFM和RGBtoHSI算法輔助優(yōu)化了引物探針的比例，提高了SERS檢測的靈敏度。在獼猴桃病原體感染早期預警和現場管理決策方面具有較大的應用前景。
合肥工業(yè)大學劉洪林課題組簡介
劉洪林，博士，教授，博士生導師，黃山學者，國家優(yōu)秀青年科學基金獲得者，國家重點研發(fā)計劃項目首席科學家。入選合肥市高層次人才、安徽省級領軍人才。獲得中國科學技術大學理學學士和工學博士學位。主要從事食品安全領域的化學與生物傳感分析、食品質量安全評價與監(jiān)控技術研究。
已主持國家重點研發(fā)計劃、國家優(yōu)秀青年科學基金、省重點研發(fā)計劃等項目10余項。已在Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Anal. Chem.、Food Chem.、LWT等雜志發(fā)表論文50余篇，入選全球Top 1%“ESI”高引論文，獲得安徽省自然科學論文一等獎、安徽省自然科學獎一等獎等獎勵。
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